احتمال انتقال بیماری های ژنتیکی به فرزندان یکی از مشکلات عمده اکثر زوجهایی است که می خواهند صاحب فرزند شوند. میزان این ریسک با ارزیابی تاریخچه خانوادگی یا سن مادر و انجام تشخیص پیش از تولد در زوج هایی که در مقایسه با جمعیت پایه ریسک بالاتری دارند شدیداً کاهش یافته است. روش جایگزینی که در کنار تکنولوژی کمکی تولیدمثلی (ART) در دسترس است، روش تشخیص ژنتیکی پیش از کاشت در رحم (PGD) است که با استفاده از آن می توان پیش از انتقال رویان به رحم مادر بیماری های ژنتیکی را غربالگری نمود. ایده PGD در اوایل دهه 1960 که تلاش هایی برای تعیین جنسیت رویان های خرگوش در مرحله بلاستوسیست انجام شد، به وجود آمد (1). این اتفاق حتی پیش از ظهور تکنیک های لقاح آزمایشگاهی (IVF) در طب تولیدمثل انسانی رخ داد (2). در سالهای پس از آن، ادغام این دو تکنیک امکان استفاده از PGD به عنوان روش جدیدی برای پیشگیری از بیماری های ژنتیکی را فراهم نمود. PGD را می توان در دو نوع شرایط به کار گرفت: این روش برای زوج هایی با ریسک داشتن فرزندی با بیماری های ژنتیکی تک – ژنی، از جمله سیستیک فیبروزیس یا انواع تالاسمی توصیه می شود؛ یا می توان آن را برای غربالگری بیماری های کروموزومی، چه عددی (آنیوپلوییدی) و چه ساختاری (معکوس شدگی ها یا جابه جایی ها) انجام داد. PGD در طب تولیدمثل به خصوص برای شناسایی عوامل ژنتیکی مرتبط با ناباروری کاربرد دارد. به علاوه تشخیص پس از آنالیز کروموزومی در رویان های یوپلویید و انتقال انتخابی آنها اثر مثبتی روی بازده کلینیکی مشاهده شده در بیماران با ریسک داشتن رویان های آنیوپلوییدی دارد. شاید این به واسطه این واقعیت باشد که ناهنجاری های کروموزومی یکی از عوامل اصلی ایجاد سقط های خود به خودی و شاید موارد ناموفق کاشت رویان در رحم باشد. بیش تحریکی تخمدان و IVF برای تهیه رویان های آزمایشگاهی متعدد ضروریست تا بتوان از این بین رویان های سالم را انتخاب نمود. معمولاً یک یا دو سلول به منظور آنالیز ژنتیکی در دسترس قرار دارد. این سلول ها از رویان های سه روزه یا از تروفوبلاست های حاصل از بلاستوسیست های گسترش یافته جدا می شوند (کاربرد بالینی نمونه برداری بلاسیست هنوز در دست بررسی بوده و بنابراین در این مقاله مروری به آن پرداخته نمی شود). از طرف دیگر اجسام قطبی را نیز می توان از اووسیت ها جدا کرده و برای بررسی بیماری هایی با منشا مادری مورد استفاده قرار داد. در هر یک از این موارد، روش تشخیصی مورد استفاده باید به اندازه کافی حساس باشد تا بتوان از آن برای مقادیر بسیار اندک DNA استفاده کرد و نیز برای به دست آوردن نتایجی با بیشترین میزان تکرارپذیری مناسب باشد. واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) به منظور شناسایی ناهنجاری های تک ژنی روش مناسبی است. به منظور دوری گزیدن از DNA با منشا خارجی و اطمینان از این که هر دو آلل طی واکنش تکثیر شده اند، استراتژی های خاصی به کار می رود. آنالیز تعداد کروموزوم های اینترفاز بر پایه پروب های DNA نشان دار شده با مواد فلورسنس خاصی در تکنیک دورگه سازی درجای DNA با پروب های فلورسنس استوار است. استفاده از پروب های چندتایی (مالتیپلکس) امکان غربالگری همزمان چندین کروموزوم را فراهم نموده و می توان با پروب های مختلف دورهای موفق FISH را تکمیل نمود. اولین کاربردهای بالینی PGD در سال 1990 (3 و 4) با اولین آبستنی های به دست آمده پس از نمونه گیری از بلاستومر و تعیین جنسیت با PCR در زوج هایی بوده است که در ریسک بالایی از داشتن فرزند مبتلا به بیماری های وابسته به کروموزوم X بوده اند (3). از آن به بعد، صدها سیکل PGD انجام شده است که گرایش رو به رشدی را برای این روش نشان می دهد. حتی در زوج های بارور و سالمی که به منظور امکان استفاده از PGD با انجام IVF موافقت می نمایند. لیست بیماری هایی که PGD برای تشخیص آنها به کار رفته است، به سرعت در حال افزایش است. به طور نظری، برای هر نوع بیماری که توالی ژنی آن در دسترس باشد می توان از PGD استفاده کرد. این اطلاعات برای طراحی پرایمرهای مورد نیاز برای تکثیر انتخابی آن ناحیه از DNA که در آن جهش روی داده، ضروریست. به طور مشابه، از روش FISH به منظور غربالگری آنیوپلوییدی ها و ناهنجاری های ساختاری کروموزوم ها از قبیل جابه جایی ها می توان استفاده کرد. مزایای این روش ها با توجه به افزایش میزان استفاده از آنها و در عین حال کاهش نرخ بروز سقط های خودبه خودی مرتبط با زنده مانی بهتر رویان های یوپلویید مشخص می گردد (5 و 6). بنابراین نه تنها PGD روش جایگزینی برای روش های پیشین مدیریت ناهنجاری های رویان که منجر به خاتمه دادن درمانی بارداری که پیش از این شکل گرفته می شدند، بلکه روشی است که راندمان فرآیند ART را به حداکثر می رساند. طی چند سال اخیر تأکید خاصی بر به حداکثر رساندن راندمان ارزیابی نمونه تک سلول صورت گرفته است. استراتژی هایی با هدف شناسایی و حذف منابع خطا و تشخیص نادرست طی روش های PCR و FISH طراحی شده است. به این ترتیب می توان تعریفی از بهترین شرایط و مقیاس های نمره دهی را ارایه داد که بالاترین میزان دقت و تکرارپذیری را برای PGD فراهم نماید. پیشرفته ترین دستاوردهای روز PGD در نشستی که کارگروه بین المللی ژنتیک پیش از کاشت طی سومین سمپوزیوم بین المللی ژنتیک پیش از کاشت در بولونیا در سال 2000 برگزار شد، گزارش گردید (7). در آن زمان، در سراسر جهان، بیش از 2500 چرخه PGD انجام شده بود که منجر به تقریباً 600 مورد آبستنی بالینی (24%) و تولد حدود 500 نوزاد گردیده است. هفت مورد ناسازگاری بین PGD و ژنوتایپ/کاریوتایپ جنین مربوطه گزارش شده که سبب شد میزان دقت به مقدار 98.2% برسد. ارزیابی کامل 236 نوزاد اولی که پس از انجام PGD متولد شدند، در مجموع 11 مورد بدریختی و نقص مادرزادی (4.7%) به دنبال داشته است. این رویداد با فراوانی نقایص مشاهده شده در جمعیت پایه قابل مقایسه است (7 و 8). یک مقاله مروری فراگیر که از روی نتایج حاصل از 1318 چرخه PGD توسط کنسرسیوم PGD موسسه ESHRE منتشر شده است (8).
شناسایی مشکلات و محدودیت های تکنیک ها، پروتوکل ها و روش ها
در PGD، روش های تشخیصی، بر پایه تکنولوژی DNA است. برای تشخیص جهش های تک ژنی مرتبط با بیماری های تک ژنی اکثراً از روش PCR استفاده می شود. در حالی که برای غربالگری آنیوپلوییدی و ناهنجاری های کروموزومی ساختاری از روش FISH استفاده می گردد. صرف نظر از نوع آنالیز ژنتیکی مورد نیاز، روش های به کار رفته جهت نمونه گیری از اووسیت یا رویان و مواد مورد استفاده در PGD، مشابه است. فرآیند نمونه گیری مستلزم دستکاری میکروسکوپی است. به برچسب زدن درست و واضح ظروف به کار رفته در نمونه گیری و کشت باید توجه خاصی نمود تا از ارتباط صحیح بین سلول نمونه گیری شده و اووسیت یا رویانی که نمونه از آن گرفته شده مطمئن شویم. یک نکته کلی این است که یک روش ارزیابی دقیق بلوغ و کیفیت اووسیت – ظهور پیش هسته ها و اجسام قطبی – و یک ارزیابی ریخت شناختی از وضعیت نمو رویان برای انتخاب مناسب مواد مورد استفاد در آنالیز ژنتیکی بسیار ضروریست (9 و 10). بنابراین یک روش ارزیابی دقیق و حرفه ای در هر مرحله ای از مورفولوژی و تکامل اووسیت برای به دست آوردن بهترین نتایج ضروریست (11).
نمونه گیری از اجسام قطبی
بخش عمده اووسیت های به دست آمده پس از القای رشد فولیکولی چندتایی در مرحله متافاز II، از طریق حضور اولین جسم قطبی (PB1) مشخص می گردد که معمولاً 36 تا 40 ساعت پس از تزریق hCG به بیرون رانده می شود. PB1 فرآورده فرعی اولین تقسیم میوز بوده و شامل بخشی از کروموزوم های اووسیت است که در این مرحله، دیپلویید است. باروری به دست آمده پس از آن، تعداد کروموزوم های درون اووسیت، با بیرون راندن یک سری 23 کروموزومی در دومین جسم قطبی (PB1) کاهش می یابد. ارزیابی دومین اجسام قطبی برای به دست آوردن تشخیص ژنتیکی خوب ضروریست. در مورد PGD برای بیماری های تک ژنی، اجسام قطبی اول و دوم (PB1 و PB2) باید پشت سر هم جدا شده و به منظور ارزیابی کراسینگ اوور احتمالی بین کروموزوم های هومولوگ طی میوز، به طور جداگانه مورد ارزیابی قرار گیرند. به منظور غربالگری آنیوپلوییدی، هر دو نوع اجسام قطبی، را می توان به طور همزمان جدا کرد و تداخل بین نتایج آنها را بر پایه این واقعیت که PB1 دیپلویید و PB2 هاپپلویید است، استوار است (9).
نمونه گیری از جسم قطبی اول (PB1)
جدا کردن PB1 از طریق دستکاری میکروسکوپی اووسیت تقریباً چهار ساعت پس از جمع آوری اووسیت ها انجام می شود. در این زمان، PB1 معمولاً از غشای تخمک (oolemma) کنده می شود. اووسیت با یک پیپت نگهدارنده، حفظ شده که در این حالت جسم قطبی در موقعیت ساعت شش یا دوازده قرار دارد. با استفاد ه از یک سوزن شیشه ای شکاف کوچکی در زونا پلوسیدا باز شده و جسم قطبی با یک پیپت شیشه ای باریک و شفاف مکیده می شود. طی اولین ساعت، تلقیح اسپرم به اووسیت، از طریق تزریق درون سیتوپلاسمی اسپرم (ICSI) با استفاده از سرنگ میکروسکوپی از راه شکافی که در زونا پلوسیدا باز شده است، انجام می شود. ICSI نه تنها برای کاهش ریسک آلودگی DNA اسپرم توصیه می شود، بلکه به منظور دوری گزیدن از بروز پلی اسپرمی که در اثر شکاف باز شده در زونا پلوسیدا ایجاد شده، نیز انجام می شود. نمونه گیری از جسم قطبی اول PB1 اثر نامطلوبی بر باروری یا تسهیم تخم ندارد. این روش به ویژه در مورد جابه جایی هایی که در تخمک زن روی داده و با آزمایش FISH با رنگ آمیزی کروموزوم تشخیص داده می شود، سودمند است.
نمونه گیری از جسم قطبی دوم (PB2)
PB2 با فرستادن یک پیپت مکنده به درون شکاف ایجاد شده، جدا می شود. این مرحله بسیار حساس و ظریف است. زیرا ممکن است هنوز ارتباطی بین PB2 غشای تخمک باقی مانده باشد. سپس تخمک هایی که مورد نمونه برداری قرار گرفته اند، به ظروف کشت برگردانده شده و تا زمان چک کردن تسهیم آنکوبه می شوند.
نمونه گیری از اجسام قطبی اول و دوم (PB1, PB2)
جدا کردن همزمان اجسام قطبی اول و دوم نیازمند تکنیکی مشابه آنچه برای نمونه گیری از جسم قطبی اول توضیح داده شد، می باشد. این استراتژی زمان به کار رفته و استرس وارد شده در اثر فرآیند دستکاری میکروسکوپی را کاهش داده و نمونه گیری و آنالیزهای ژنتیکی را تنها به اووسیت های بارور شده سالم محدود می نماید. با این حال، هنوز ملاحظاتی درباره تغییرات دژنراتیو مشاهده شده در PB1 در زمان کنترل لقاح باقی مانده است. در نتیجه با انجام نمونه برداری از اجسام قطبی رویان دست نخورده باقی می ماند. زیرا تنها فرآورده های فرعی میوز به منظور آنالیز ژنتیکی اووسیت به کار رفته اند. در مواردی که انجام PGD امکان پذیر نیست، نیز می توان از این روش استفاده کرد. البته در اینجا ناهنجاری های با منشا پدری و آنهایی را که پس از انجام لقاح یا اولین تقسیمات رویان به وجود آمدند، نمی توان شناسایی کرد.
نمونه برداری از بلاستومر
معمولاً 62 تا 64 ساعت پس از تلقیح، از یک یا دو بلاستومر، نمونه برداری انجام می شود. این محدودیت زمانی به واسطه این واقعیت است که در این زمان فشردگی رویان روی می دهد. چنانچه این مراحل هنگامی انجام شوند که برهمکنش های سلول – سلول و ارتباطات سلولی آغاز شده باشند، احتمال بروز آسیب های سلولی بالاست. از طرف دیگر، رویان ها را می توان در یک محیط کشت با کمبود یک کاتیون دو ظرفیتی شستشو داد تا اتصالات محکم بین سلولی و حالت چسبندگی بین سلول ها از بین برود. فرآیند نمونه برداری شامل باز کردن شکافی در لایه زونا پلوسیدا با قطر تقریبی 20 تا 25 میکرومتر است. برای این کار سه راه مختلف پیشنهاد می گردد.
مکانیکی
به منظور ایجاد شکاف در لایه زونا پلوسیدا از سوزن میکروسکوپی شیشه ای استفاده می گردد. در این روش یک شکاف مثلثی V شکل یا یک دریچه مربع شکل ایجاد می شود (9). این روش وقت گیر بوده و نیازمند یک اوپراتور ماهر است.
شیمیایی
پس از برداشتن محلول تایرود اسیدی (با pH برابر 2.35) در یک پیپت با قطر 12 میلیمتر، بلاستومر های انتخاب شده برای نمونه برداری در موقعیت ساعت 3 قرار می گیرد. لبه بیرونی بلاستومر مورد فوکوس میکروسکوپ قرار گرفته و پیپت به سرعت در تا نزدیکی رویان پایین آورده می شود. فوکوس میکروسکوپ را با بلاستومر مورد نظر و نوک پیپت حاوی محلول اسیدی تنظیم کرده و محلول اسیدی با توجه به موقعیت بلاستومر مورد نظر، در نقطه ای روی زونا پلوسیدا ریخته می شود. هنگامی شکاف باز شد، مقادیر اضافی محلول اسیدی موجود در محیط کشت در نزدیکی رویان با استفاده از همان پیپت محلول اسیدی مکیده می شود. از این روش بیشتر استفاده می گردد (8).
لیزر تماسی
یک میکرودریل غیر تماسی برای ایجاد یک شکاف در لایه زونا پلوسیدا مورد استفاده قرار گرفته و نیازی به جدا کردن رویان ها از محیط کشت نخواهد بود (14). این روش اگرچه خیلی سریع و دقیق است، اما هنوز داده های کافی برای مناسب بودن این روش برای اووسیت و رویان های انسانی در دسترس نیست تا کاربرد آن را فراگیرتر سازد. هنگام باز کردن شکاف در زونا پلوسیدا، موقعیت رویان به نحوی تنظیم می گردد تا یک بلاستومر هسته دار در موقعیت ساعت سه قرار گیرد. حضور یک هسته برای آنالیز DNA ضروری است. متأسفانه هسته ها همیشه قابل مشاهده نبوده و در این مورد، انتخاب بلاستومر عمدتاً بر اساس اندازه اش و ظاهر سیتوپلاسمی اش است تا شانس برداشتن نمونه های بدون هسته کاهش یابد. یک پیپت شیشه ای با قطر 30 تا 40 میکرومتر تا نزدیکی شکاف زونا پلوسیدا آورده می شود. فوکوس میکروسکوپ بر روی لبه بیرونی بلاستومر و نوک پیپتی که بلاستومر را می مکد تنظیم می گردد. با استفاده از مکیدن بسیار ملایم، بلاستومر به آهستگی به درون پیپت هدایت شده و سپس در محیط کشت رها می گردد. به منظور دوری گزیدن از ایجاد پارگی و آسیب به سلول نمونه برداری شده و همچنین به بلاستومرهای دیگر، به دقت بسیار بالایی نیاز است. پس از تهیه نمونه، رویان را به دقت شسته، در محیط کشت تازه ای قرار داده و تا زمان انتقال در آنکوباتور گذاشته می شود. سلول های نمونه برداری شده در ظروف ویژه دستکاری میکروسکوپی در دمای اتاق گذاشته می شود. در نتیجه، PGD با بلاستومر، به واسطه امکان غربالگری بیماری های با منشا مادری و پدری و نیز بیماری های که پس از لقاح به وجود می آیند، دارای ارجحیت است. اگرچه توده سلولی رویان کاهش می یابد، هیچگونه اثرات زیان بخشی برای زنده مانی رویان گزارش نشده است (15). در واقع، داده هایی از نتایج بالینی رویان های نمونه برداری شده، نشان داده اند که تقریباً یک چهارم این رویان ها را می توان در رحم کاشت (5). از سویی دیگر، موزایسم که به نظر می رسد در رویان هایی که در شرایط آزمایشگاهی تهیه شده اند، یک حالت عادی باشد، می تواند نشان دهنده یک محدودیت موجود در تشخیص ژنتیکی در مرحله تسهیم باشد. این مشکل احتمالاً در مورد نمونه برداری از بلاستوسیست نیز باقی خواهد ماند (16 و 17).
آنالیز کروموزومی
سلولهای به دست آمده از نمونه برداری که در بالا شرح داده شد را در محلول هیپوتونیک قرار داده، با متانول و اسید استیک گلاسیال روی اسلاید شیشه ای فیکس کرده، در غلظت های افزایشی اتانول آبگیری نموده و طبق پروتوکول دورگه سازی آن را آنکوبه می نمایند.
انجام فرآیند تثبیت برای به دست آوردن تشخیص نهایی درست، حیاتی است.
رایج ترین مشکلات عبارتند از:
از دست دادن سلول طی تثبیت. مشاهده زیر میکروسکوپ طی تثبیت ضروریست؛ موقعیت هسته تثبیت شده باید با کشیدن دایره به دورش با قلم الماس مشخص گردد.
بقایای سیتوپلاسم. تمامی سیتوپلاسم باید به طور کامل محلول شود تا با تفسیر سیگنال های فلورسنت تداخل ایجاد نکند. مواد تثبیت کننده را باید هنگامی که سلول ها شروع پهن شدن کرده و پیش از خشک کردن کامل محلول هیپوتونیک افزود.
کاهش گسترش کروماتین. زمان بندی درست برای افزودن مواد تثبیت کننده برای به دست آوردن یک گسترش کروماتین خوب ضروریست. همبستگی منفی بین قطر هسته تثبیت شده و ظهور سیگنال های همپوشان ثابت شده است (18).
از دست رفتن ریزهستک ها. به دنبال ایجاد شکاف در غشای سیتوپلاسمی، افزودن مواد تثبیت کننده اضافی اغلب می تواند سبب از دست رفتن ریزهستک ها (و کروموزوم ها) شود که به راحتی با میزان بروز بالای مونوزومی های کاذب شناسایی می شود (19).
پس از آبگیری از هسته های تثبیت شده، پروب های نشان دار با فلورسنس افزوده می گردد تا بتوان روش FISH مالتیپلکس با چند رنگ را انجام داد. توجه به این موارد الزامیست:
افزودن پروب به همان سمت اسلاید شیشه ای که هسته ها تثبیت شدند؛
دوری گزیدن از هر گونه خراش و لمس نکردن سطحی از اسلاید شیشه ای به وسیله پیپتی که با آن کار می شود؛
دوری گزیدن از تشکیل حباب هوا، به ویژه هنگام گذاشتن لامل.
یک واسرشت سازی همزمان پروب های DNA و DNA نمونه در دمای 68 تا 73 درجه سانتیگراد به مدت سه تا پنج دقیقه انجام می شود ( این شرایط بسته به مخلوط پروب های به کار رفته و پروتوکل مورد اجرا در هر آزمایشگاهی شدیداً متفاوت است).
اتصال مجدد رشته های DNA و تشکیل دورگه ها پس از آنکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد به مدت دست کم سه ساعت در مورد بلاستومرها انجام می گیرد، اما برای اجسام قطبی آنکوباسیون طولانی تری لازم است. در پایان واکنش، پروب های اضافی (متصل نشده یا متصل شده ی غیر اختصاصی) با شستشو در دماهای بالا (71 تا 73 درجه سانتیگراد) در محلول نمکی برداشته می شود. پس از رنگ آمیزی با رنگ های متضاد در محلول کدورت زدا، سیگنال های فلورسنت با بزرگنمایی 600 برابر با میکروسکوپ فلورسنس نمره دهی می شوند. برای تفسیر سیگنال های فلورسنت، استانداردهایی تعریف شده است (9 و 19). دورگه سازی دوباره همان سلول نمونه برداری شده با پروب های اضافی در دور بعدی FISH بسیار مهم است. زیرا این کار، اطلاعات به دست آمده را به تعداد بیشتری از کروموزوم ها گسترش می دهد (20). گرفتن سیگنال های فلورسنت روی یک سیستم آنالیز تصویر کامپیوتری نه تنها به ذخیره آن کمک می کند، بلکه برای تفسیر و مرور سیگنال های تشخیص داده شده نیز سودمند است. رایج ترین منابع خطا طی این مراحل کاری، از دست رفتن ریزهستک ها، همپوشانی سیگنال ها روی هم، خرابی دورگه سازی، استانداردهای نامناسب نمره دهی برای تفسیر سیگنال های جدا از هم و موزاییسم است. به منظور دوری گزیدن از خطاهی تکنیکی مرتبط با تثبیت کروماتین، دورگه سازی و تفسیر سیگنال های درست، اقدامات احتیاطی خاصی انجام می گیرد. موزاییسم هنوز به عنوان یک منبع خطای تشخیص نادرست مطرح است؛ اما آنالیز همزمان چندین کروموزوم در شناسایی ناهنجاری های پیچیده بسیار سودمند است (21). جدیدترین گزارش درباره دقت نتایج حاصل از FISH در نمونه های تک سلول حدود 97% است (7).
آنالیز ژنتیکی برای بیماری های تک ژنی
پس از کامل شدن فرآیند نمونه برداری، سلول جدا شده را در زیر استریوسکوپ به درون یک تیوب میکروسنتریفیوژ حاوی بافر تجزیه منتقل می کنند. سپس با استفاده از رایج ترین روش ها مثل تیمار با پروتئیناز K یا هیدروکسید پتاسیم به اضافه دی تیوتریتول عمل تجزیه سلول انجام میگرد. مشکل عمده PCR احتمال آلودگی با DNA با منشا خارجی است که منشا اصلی آن اغلب مادری (سلول های کومولوس) یا پدری (سلول اسپرم) است. همچنین منشا این DNA خارجی ممکن است خود کارکنان آزمایشگاه باشند. در هر دو آزمایشگاه باید مراقبت های خاصی انجام گیرد. زیرا شرایط استریل استاندارد برای پیشگیری از آلودگی DNA کافی نیست.
در آزمایشگاه IVF:
تمامی مواد یک بار مصرف، محیط های کشت و روغن های به کار رفته در کشت و دستکاری میکروسکوپی در موارد PGD باید از بسته های استریل و باز نشده تهیه گردند؛
در همه مراحل نیاز به دستکش ها، ماسک ها و گان های استریل است؛
ابزارهای دستکاری میکروسکوپی را پیش از استفاده در برابر تابش ماورای بنفش قرار می گیرند؛ و
در زمان نمونه برداری، تنها دو جنین شناس که مشغول کارند، مجازند در آزمایشگاه رفت و آمد کنند تا جریان هوای ناشی از حرکت افراد به حداقل برسد.
در آزمایشگاه ژنتیک:
برای PCR و PGD اتاق هایی اختصاصی، جداگانه و کاملاً مجهز باید در نظر گرفته شود.
طی انجام آنالیز و مراحل آماده سازی، دسترسی به آزمایشگاه PCR، باید محدود گردد.
باز کردن تیوب های حاوی نمونه و مواد آزمایشی باید به حداقل ممکن کاهش یابد؛ و
یک روز پیش از استفاده از مواد آزمایشی، باید تمامی آنها را با انجام یک PCR شاهد، از نظر آلودگی DNA ارزیابی نمود تا وجود احتمالی DNA انسانی در آنها تشخیص داده شود.
به منظور تفسیر نتایج، علاوه بر شاهد مثبت، یک سری شاهد منفی نیز طی واکنش انجام می شود تا حضور DNA خارجی را در محیط کشت اووسیت یا رویان نشان دهد. به علاوه مارکرهای چندشکل به عنوان روش کمکی دیگری برای شناسایی DNA خارجی هستند. برای آنالیز فرآورده های PCR روشهای مختلفی به کار می رود که تشکیل هترودوبلکس و هضم با آنزیم های برشی رایج ترین آنهاست (22 و 23). یک روش جایگزین، PCR فلورسنت (F-PCR) است که در آن پرایمرهای نشاندار با مواد فلورسنس به کار می رود. در این مورد، فرآورده های تکثیر روی یک آشکارساز فلورسنس که در مقایسه با سیستم ژل استاندارد بسیار حساس تر است، ارزیابی می گردد. F-PCR به ویژه برای تشخیص موتاسیون های نقطه ای که توالی یابی مستقیم فرآورده های PCR ضروریست، بسیار سودمند است (24). تفسیر درست نتایج PCR ممکن است در اثر مشکل تکثیر ترجیحی یک آلل بر دیگری یا ADO (کنارگذاشتن یک آلل) خدشه دار شود. این پدیده به PCR با تک سلول محدود نمی شود. اما در اینجا، پیامدها شدیدتر بوده و می تواند منجر به تکمیل نتایج اشتباه گردد. استراتژی هایی برای شناسایی ADO تعریف شده است. کارآمدترین اینها، منحصر به آن تعریفی از مارکرهای چندشکل است که به شدت به ژن مورد مطالعه پیوسته است (7). این مارکرها معمولاً شامل تکرارهای کوتاه پشت سرهم (STRs) که توالی های کوتاهی، 2 تا 5 جفت باز به ازای هر واحد تکراری هستند که در سراسر ژنوم انسان پراکنده اند و عمدتاً در نواحی بین ژنی واقع شده اند. STR ها با ژنی که به شدت به آن پیوسته اند، در یک واکنش PCR مالتیپلکس با حضور چندین پرایمر در یک مخلوط تکثیر، به طور همزمان تکثیر می شوند. F-PCR تکنیک انتخابی برای تکثیر همزمان ژن مورد مطالعه و مارکرهای پیوسته حاوی اطلاعات مربوطه است. اگر دو یا چند مارکر حاوی اطلاعات برای جهش مورد نظر در دسترس باشد، عمده ADO ها شناسایی شده و منجر به افزایش دقت تا حد 97 درصد می گردد (9 و 25).
بایدها و نبایدها برای PGD
کاربرد PGD لزوماً نیازمند تکنیک های ART بوده و حتی زوج های بارور و سالم باید تمامی مراحل مربوط به تیمارهای ART، از جمله القای رشد فولیکول های چندتایی، برداشت اووسیت در ساعات 34 تا 36 پس از تزریق hCG و تلقیح آزمایشگاهی اووسیت ها، باید رویشان انجام شود. به عنوان یک توصیه عمومی، برای شناسایی جنین های دارای ناهنجاری مورد نظر، چندین جنین لازم است. بنابراین یک پاسخ مناسب به بیش تحریکی، الزام مهمی است. به خصوص هنگامی که جنین ها نه تنها بر اساس آنالیز ژنتیکی شان منتقل می شوند، بلکه بر اساس مورفولوژی شان نیز باشد. این روش، دقت انتخاب جنین را بالا می برد. زیرا نتایج PGD یک استاندارد انتخاب اضافی را نیز دربرمی گیرد. چنانچه بروز بیماری در جنین 25 درصد تخمین زده شود، در مورد بیماری های تک ژنی با توارث مندلی، فراوانی عدم تعادل کروموزومی به درصدهای بالاتری در گروه های بیماران انتخاب شده خواهد رسید (26). در این موارد، نرخ آبستنی نشان داده است که به طور مستقیم به تعداد اووسیت تولید شده مرتبط بوده و در نتیجه کیفیت پاسخ به بیش تحریکی فولیکولی فاکتوری برای موفقیت در سیکل PGD خواهد بود (27). برخی تکنیک های پیشرفته تر کمکی تولیدمثل ART موجب افزایش چشمگیری در راندمان PGD شده اند. با استفاده از ICSI به عنوان تکنیک تلقیح، راندمان تولیدمثل بهبود یافته و لذا ریسک آلودگی DNA اسپرمی به حداقل رسیده است. به علاوه، انجماد رویان، به ویژه هنگامی که در مرحله دو پیش هسته ای انجام شود، امکان زمان بندی انتقال رویان را فراهم می نماید. نتایج گزارش شده در دهه ی پیش نشان می دهد که PGD گزینه با ارزشی برای زوج های با ریسک بالای تولیدمثلی شده است. لیستی از بیماری هایی که برای تشخیص آنها می توان از PGD استفاده کرد، به سرعت در حال افزایش است. در مورد تشخیص آنیوپلوییدی، به منظور انتخاب مجموعه ای از پروب ها برای کروموزوم های مربوطه، انجام کاریوتایپ از خون محیطی والدین ضروریست. در بیمارانی که سن مادرشان بالاست، معمولاً این انتخاب شامل کروموزوم هایی است که آنیوپلوییدی شان در سقط های خود به خودی و تولدهای زنده، رایج تر است، از جمله کروموزوم های X، Y، 13، 16، 18، 21 و 22. پروب های اضافی را نیز می توان برای تشخیص کروموزوم های دیگری که خطاهایشان ممکن است اثری بر کاشت رویان در رحم داشته باشد، در اینجا استفاده کرد. نتایج به دست آمده می تواند اطلاعات مفیدی درباره نقش تک کروموزوم ها در کاشت موفق رویان در رحم در اختیار قرار دهد. به طور نظری این امکان وجود دارد که آنیوپلوییدی های این کروموزوم ها که به نظر می رسد اهمیت بالینی داشته باشند، چنان اثرات زیان بخشی دارند که به واسطه ی نقصی اولیه در نمو رویان، لانه گزینی رویان در رحم هرگز روی نخواهد داد. هنگامی که یکی یا هر دوی والدین حامل یک کاریوتایپ تغییر یافته از قبیل یک جابجایی متعادل باشند، انتخاب پروب ها باید شامل این پروب های اختصاصی برای ناهنجاری مربوطه باشد. در مورد جابه جایی های دوطرفه، ترکیب مناسبی از پروب های تلومری و سانترومری که برای بیماری مورد مطالعه اختصاصی هستند باید شناسایی گردند. تست های اولیه پروب های انتخاب شده از لمفوسیت های فرد حامل برای تأیید کارایی این سیستم توصیه می گردد. انجام PGD برای ناهنجاری های تک ژنی، یک مرحله آماده سازی طولانی را دربرمی گیرد که با تخمین موتاسیون های تشخیص داده شده در لمفوسیت های زوجین آغاز می گردد. تمامی ناهنجاری های تک ژنی، در اصل، با PGD قابل تشخیص است، به شرطی که ناحیه رمز کننده مربوطه توالی یابی شده باشد و موتاسیون آن شناسایی شده باشد. این مرحله برای طراحی و ساخت اکثر پرایمرهای مناسب ضروریست. آزمایش PCR برای هر بیماری خاص، باید طراحی گردد و باید توجه نمود که به نحوی باشد که مارکرهای چندشکل پیوسته به بیماری را دربرگفته و حاوی اطلاعات مفید (در صورت وجود) بوده به نحوی که وجود آلودگی DNA خارجی و وقوع ADO در آن قابل شناسایی باشد. هنگامی که پروتوکل PCR تکمیل شده و روش PGD برای بیماری مورد مطالعه قابل اجرا به نظر رسید، تمامی مواد مورد استفاده باید از جهت عاری بودن از DNA ارزیابی شوند. هیچگونه منعی برای انجام PGD وجود ندارد. مگر در مواردی که به رشد چندتایی فولیکولی از طریق بیش تحریکی یا شروع بارداری ارتباط دارد. همه زوج های با ریسک بالای تولیدمثلی می توانند PGD را بدون توجه به وضعیت باروری شان، به عنوان مثال، حامل های بارور ناهنجاری های تک ژنی به عنوان جایگزین سقط درمانی در نظر گیرند. برای PGD در آنیوپلوییدی ملاحظات متفاوتی مورد نیاز است که هدف آن افزایش شانس لانه گزینی رویان در رحم از طریق دوری گزیدن از انتقال رویان های دارای آنیوپلوییدی یا ناهنجاری های کروموزومی ساختاری است. حامل های جابه جایی های دوطرفه اغلب بارور بوده اما پیش آگهی بسیار ضعیفی از آن دارند به طوری که جدا شدن نامتعادل با نرخ بسیار بالایی روی می دهد. انتخاب رویان هایی با کاریوتایپ طبیعی یا متعادل می تواند پیش آگهی ضعیف مرتبط با این وضعیت را تخفیف دهد که با وقوع بالای سقط های خودبه خودی مشخص می گردد (12).
آمادگی بیماران
استفاده از PGD در دهه گذشته افزایش در خور توجهی داشته است. بررسی داده های جمع آوری شده امکان شناسایی گروه های مختلف بیمارانی که در آنها انجام PGD ضروریست، فراهم گردیده است.
ناهنجاری های کروموزومی
ناهنجاری های کروموزومی عددی با شکست در کاشت رویان در رحم و نرخ بالای مرگ و میر رویان در ارتباط است. آنیوپلوییدی عمدتاً از جدانشدن کروموزوم طی گامتوژنز ایجاد شده و با افزایش سن مادر به طور قابل ملاحظه ای افزایش می یابد (28). جدا نشدن کروموزوم ها می تواند پس از لقاح نیز روی دهد که منجر به تشکیل رویان های موزاییک گردد که در این موارد بلاستومر های نرمال، مونوزومی و تریزومی می توانند همزمان با هم در ترکیبی از ناهنجاری های پیچیده تر وجود داشته باشند (29). اکثر موارد آنیوپلوییدی در ارتباط با نقص در کاشت رویان در رحم یا سقط خود به خودی هستند. اگر چه برخی از آنها (به عنوان مثال تریزومی 13، 18، 21 و آنیوپلوییدی کروموزوم های جنسی) قادر به گسترش مفهوم این اصطلاح اند. تمامی ناهنجاری های کروموزومی حتی آنها که پیچیده ترند، در توده سلولی درونی بلاستوسیست های انسانی شناسایی گردیده اند (16 و 17). این یافته ها نشان می دهند که معیارهای مورفولوژیک از قبیل تکامل بلاستوسیست به تنهایی، برای تأیید انتخاب رویان های یوپلویید و زنده مان کافی نیستند. چنانچه در نشست کارگروه بین المللی ژنتیک پیش از لانه گزینی گزارش شد، بیش از 1500 چرخه PGD در سراسر جهان انجام شده که منجر به حدود 400 بارداری گردیده است (7). گروه های بیماران اشاره شده در زیر بررسی شده اند:
سن مادر 36 سال یا بیشتر
بر اساس مهمترین مطالعات انجام شده، درصد رویان های با ناهنجاری های کروموزومی در مواردی که سن مادر 36 سال یا بیشتر است، تقریباً 65 درصد بوده که این میزان با افزایش سن مادر افزایش می یابد. دستاورد مهمی در راندمان بالینی به دست آمده پس از انجام PGD، افزایش نرخ لانه گزینی و کاهش فراوانی سقط های خود به خودی بوده است (5 و6). این به خصوص در مورد زنان با سن بالای 42 سال که شانس بارداری شان پس از PGD همانند زنان جوان تر باشد، درست است (30). در سنین بالاتر، شاید عوامل دیگری نیز در کاهش نرخ موفقیت نقش دارند.
زوج های با بیش از سه بار شکست در IVF
میزان بروز شکست های IVF توضیح داده نشده ی چندگانه در بیماران جوان شاید به واسطه اثر ترکیبی عوامل زیادی باشد. فراوانی ناهنجاری های کروموزومی در این گروه بیماران به بیش از 55 درصد می رسد؛ اما انتخاب آنهایی که مکمل یوپلوییدی دارند، بهبودی در پیش آگهی بالینی ایجاد نمی کند و نرخ بارداری پس از FISH مشابه گروه شاهد بوده است (5). هاپلوییدی، پلی پلوییدی و ناهنجاری های پیچیده، فراوان ترین ناهنجاری های کروموزومی شناخته شده اند. این یافته ها نشان می دهند که احتمالاً تقسیمات میتوزی تغییر یافته به ناهنجاری های سانتریولی مرتبط بوده که نشان دهنده منشا این خطاهاست (13). از طرف دیگر، کروموزومهای دیگری در کنار این کروموزوم های غربال شده نقش مهمی در زنده مانی رویان ها دارند (26 و 32).
کاریوتایپ تغییر یافته به واسطه موزاییسم کروموزومی یا جابه جایی های متعادل
شکست های فراوان در لانه گزینی و میزان بروز بالای سقط به میزان قابل ملاحظه ای با انتقال رویان های یوپلویید کاهش می یابد (5). در این گروه های بیماران، فراوانی رویان های با ناهنجاری کروموزومی 62 درصد و رویان های با مونوزومی و تریزومی 46 درصد از ناهنجاری ها را تشکیل می دهد. به خصوص به نظر می رسد که حامل های جابه جایی متعادل، رویان های نامتعادلی را به وجود می آورند (تقریباً 80 درصد). چنانچه تعداد قابل قبولی از رویان های طبیعی یا متعادل قابل شناسایی باشد، نرخ بالاتری از نتایج لانه گزینی حاصل از رویان های انتخاب شده با FISH به دست می آید (12).
اسپرم تهیه شده از اپیدیدمیس یا بیضه با بیش از یک بار شکست در IVF
درصد بسیار بالایی از رویان های با ناهنجاری کروموزومی (72 درصد) در این گروه بیماران به دست آمده است (33). انتقال رویان های انتخاب شده با PGD منجر به نرخ بارداری بالینی 25 درصد با نرخ لانه گزینی 18.8 درصد می شود. این راندمان بالینی همانند نتایجی که در بیماران با شکست های مکرر در IVF مشاهده شده، است. اما شاید عوامل ایجاد این پیش آگهی ضعیف، چنانچه از نوع ناهنجاری های مشاهده شده به نظر می آید، متفاوت باشد. به نحوی که 45 درصد به واسطه مونوزومی و تریزومی بوده و جالب توجه این که 8.6 درصد از رویان های دارای ناهنجاری، آنیوپلوییدی های گونوزومی نشان می دهند. مشارکت مرد نیز در اتیولوژی این تغییرات، امکان پذیر است.
سقط های مکرر
داده های اولیه درباره این وضعیت نرخ بالایی (68 درصد) از رویان های با ناهنجاری کروموزومی را نشان می دهند (30). اگرچه نتایج اولیه درباره نرخ تولدهای زنده، امیدوارکننده است، اما به منظور ارزیابی ارزش روش PGD پیشنهادی برای آنیوپلوییدی در این گروه بیماران، داده های بیشتر و مطالعات مقایسه ای ضروریست (34).
ناهنجاری های تک ژنی
در حال حاضر، حدود 750 چرخه PGD برای ناهنجاری های تک ژنی در سراسر جهان انجام شده که حدود 150 مورد بارداری و بیش از 100 مورد تولد نوزاد سالم در پی داشته است (7). PGD برای 26 ناهنجاری گزارش شده و لیست این بیماری ها به سرعت در حال افزایش است. به خصوص کاربردهای این روش برای جهش های دینامیک از قبیل سندرم X شکننده، بیماری هانتینگتون و دیستروفی ماهیچه ای بسیار نوآورانه است که با گسترش کلاس تکرار های تری نوکلئوتیدی که در درون نواحی رمزگردان و ترجمه نشده ژن ها قرار دارد، مرتبط است (35، 36 و 37). استفاده از مارکرهای مالتیپلکس قابلیت اعتماد این روش تشخیص را به میزان قابل توجهی افزایش داده است. به منظور کاهش ریسک تشخیص اشتباه، به ویژه در مورد جهش های حاوی اطلاعات کم یا بدون اطلاعات، روشهای ابداعی جدیدی در دست بررسی و بازنگری است. برای اینگونه بیماری ها، نگرانی ویژه ای درباره اطلاعات داده شده به بیمارانی که از وضعیت خود آگاه نیستند (به عنوان مثال بیماری هانتینگتون) در حال افزایش است. گزارش شده که زمینه ژنتیکی برای بیماری های دیررس دلیل مناسبی برای انجام PGD است (7). افراد حامل جهش ژن سرکوبگر تومور p35، در ریسک بالاتری از زمینه ارثی سرطان به سر می برند. به منظور انتخاب رویان های عاری از این نوع جهش می توان از PGD استفاده کرد. این که آیا وجود یک زمینه ژنتیکی برای بیماری های سخت می تواند معیاری برای انتقال رویان های انتخاب شده و سالم تشخیص داده شده، باشد یا خیر، جای بحث دارد. انجام PGD برای جور شدن HLA امکان بارداری را در جایی که نوزاد ممکن است یک دهنده احتمالی پیوند برای برادر یا خواهر مبتلایش باشد که نیاز به پیوند مغز استخوان دارد، فراهم می نماید. با روش های آنالیز ژنتیکی می توان از بین رویان های سالمی که هاپلوتایپ شان با کودک بیمار جور می شود، انتخاب نمود (7). در نتیجه روش PGD برای بیماری های تک ژنی، نه تنها تکنیکی برای آغاز یک بارداری سالم است، بلکه یک روش عمومی برای پیشگیری و درمان بیماری های ژنتیکی نیز هست.
ارزیابی سود- خطر
نمونه گیری از اووسیت و رویان، روش های تهاجم بوده و با توجه به تکامل و زنده مانی رویان پس از انجام نمونه گیری، نگرانی هایی وجود دارند. آزمایشات نشان داده اند که نمونه گیری در مرحله هشت سلولی هیچگونه اثرات زیان بخشی بر رشد و تکامل بعدی رویان ندارد (15). مهمتر این که داده های بالینی به دست آمده از رویان های نمونه گیری شده، نشان می دهد که تقریباً یک چهارم از آنها را می توان در رحم کاشت (5). تشخیص بیماری های ژنتیکی مبتنی بر آنالیز تک سلول مستلزم انجام تکنولوژی شدیداً پیچیده و مراقبت های ویژه ایست تا دقت این روش را بیشینه نماید. به منظور ارزیابی کارآیی این روش، مراقبت های ویژه ای اعمال شده است. پیشرفت های چشمگیری در شناسایی عوامل احتمالی تشخیص اشتباه، از جمله تعریف راهنماهایی برای آزمایشگاه های ART هنگام کار با موارد PGD ارایه شده است (38). در مورد PGD برای آنیوپلوییدی، کنترلی برای کیفیت نتایج به دست آمده با تکرار نمونه گیری از رویان های منتقل نشده و انجام FISH روی بلاستومرهای به دست آمده انجام می شود (19، 20 و 39). نتایج، راندمان آزمایشگاهی 97 درصدی را نشان می دهد که با راندمان آزمایشات in vivo (97.8 درصد) تطابق دارد. راندمان آزمایشات in vivoاز طریق داده های به دست آمده از تشخیص پیش از تولد بارداری های به وجود آمده یا ارزیابی مستقیم نوزادان در هنگام تولد محاسبه می گردد (7). مقادیر مشابهی از PGD برای بیماری های تک ژنی گزارش شده است (7 و 9). اعمال مراقبت های ویژه برای پیشگیری از آلودگی با DNA خارجی و ADO، عوامل اصلی تشخیص اشتباه را شدیداً محدود نموده است. در سراسر جهان، تنها شمار اندکی، تشخیص های اشتباه گزارش شده (کارگروه بین امللی ژنتیک پیش از لانه گزینی در سال 2001، تنها هفت مورد تشخیص اشتباه را گزارش نموده است)؛ این تعداد، PGD را به عنوان روشی ایمن و قابل اعتماد مطرح می سازد. با وجود این نتایج، هنوز هم لازم است که روش های رایج تشخیص پیش از تولد، به بیماران توصیه گردد تا بتوان نتایج به دست آمده از PGD را با کمک روش های آمنیوسنتز یا نمونه گیری از پرزهای کریونی (CVS) تأیید نمود. اخیراً، PGD برای آنیوپلوییدی، معیار بسیار محکمی برا انتخاب رویان های زنده مان شناخته می گردد. در این مورد، نرخ خالص بالاتر تولد پس از انجام PGD برای آنیوپلوییدی (5 و 6) نشان می دهد که هزینه یک چرخه درمان موفق با PGD ارزان تر از همان تعداد چرخه ART است که برای یک تولد زنده مورد نیاز است. از طرف دیگر، اکثر بیماران بارور که تصمیم دارند به PGD تن دردهند، آنهایی هستند که یا با سقط درمانی به شدت مخالفت می کنند یا کسانی که از پیش تجربه پایان دادن به بارداری با جنین بیمار را دارند. متأسفانه، نگرانی های اصلی موجود، تنش همراه این روش، نرخ حاملگی نسبتاً پایین و هزینه مالی بالا هستند. اینها به ویژه برای کشورهایی درست است که با وجود مزایای زیاد این روش برای اکثر زوج های مایل به داشتن فرزندی سالم، قصد ندارند فن آوری های کمکی تولید مثل (ART) از جمله روش های PGD را راه اندازی نمایند. همیشه گفته شده که پیشگیری از بیماری های ژنتیکی بسیار ارزان تر بوده تنها هزینه پشتیبانی از این فن آوری، مستلزم انجام تشخیص ژنتیکی است.
نتایج
پس از گذشت ده سال از ابداع PGD در پزشکی تولیدمثل و انجام تقریباً 2500 چرخه PGD، نتایج اصلی به دست آمده بدین ترتیب است که PGD روشی معتبر برای پیشگیری از تولد فرزندان بیمار بوده و این که می تواند جایگزینی برای سقط درمانی باشد. PGD برای آنیوپلوییدی، سودمند بوده و هنگامی که در گروه هایی از والدین انتخاب شده به کار رفت، منجر به افزایش نرخ خالص تولد نوزاد زنده گردید. با وجود راندمان بالای این تکنیک، هنوز هم روش های رایج تشخیص پیش تولد توصیه می گردد.
References
1. Gardner RL, Edwards RG. Control of the sex ratio at full term in the rabbit by transferring sexed blastocysts. Nature (London), 1968, 218:346–348.
2. Steptoe PC, Edwards RG. Birth after reimplantation of a human embryo. Lancet, 1978, 2:366.
3. Handyside AH et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature (London), 1990, 344:768–770.
4. Verlinsky Y et al. Analysis of the first polar body: preconception genetic diagnosis. Human Reproduction, 1990, 5:826–829.
5. Gianaroli L et al. Preimplantation diagnosis for aneuploidies in patients undergoing in vitro fertilization with a poor prognosis: identification of the categories for which it should be proposed. Fertility and Sterility, 1999, 72:837–844.
6. Munné S et al. Positive outcome after preimplantation diagnosis of human embryos. Human Reproduction, 1999, 14:2191–2199.
7. International Working Group on Preimplantation Genetics. 10th Anniversary of Preimplantation Genetic Diagnosis. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 2001, 18:66–72.
8. ESHRE PGD Consortium Steering Committee. ESHRE preimplantation genetic diagnosis (PGD) consortium: data collection II (May 2000). Human Reproduction, 2000, 15:2673–2683.
9. Verlinsky Y, Kuliev A. An atlas of preimplantation genetic diagnosis. London, The Parthenon Publishing Group, 2000.
10. Magli MC et al. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology, 2001, 183:29–34.
11. Gianaroli L e t a l. Atlas of embryology. Human Reproduction, 2000, 15 (Suppl. 4), Oxford University Press.
12. Munné S et al. Outcome of preimplantation genetic diagnosis of translocations. Fertility and Sterility, 2000, 73:1209–1218.
13. Dumoulin JC et al. Effect of Ca2+/Mg2+-free medium on the biopsy procedure for preimplantation genetic diagnosis and further development of human embryos. Human Reproduction, 1998, 13:2880–2883.
14. Germond M et al. Improved fertilisation and implantation rate after non-touch zona pellucida microdrilling of mouse oocytes with a 1.48 mm diode laser beam. Human Reproduction, 1996, 11:1043–1048.
15. Hardy K et al. Human preimplantation development in vitro is not adversely affected by biopsy at the 8-cell stage. Human Reproduction, 1990, 5:708–714.
16. Evsikov S, Verlinsky Y. Mosaicism in inner cell mass of human blastocysts. Human Reproduction, 1998, 13:3151–3155.
17. Magli MC et al. Chromosome mosaicism in day 3 aneuploid embryos that develop to morphologically normal blastocysts in vitro. Human Reproduction, 2000, 15:1781–1786.
18. Munné S et al. Reduction in signal overlap results in increased FISH efficiency: implications for preimplantation genetic diagnosis. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1996, 13:149–156.
19. Munné S et al. Scoring criteria for preimplantation genetic diagnosis of numerical abnormalities for chromosomes X, Y, 13, 16, 18, and 21. Molecular Human Reproduction, 1998, 4:863–870.
20. Gianaroli L et al. Advantages of day four embryo transfer in patients undergoing preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1996, 16:170–175.
21. Delhanty JDA et al. Multicolour FISH detects frequent chromosomal mosaicism and chaotic division in normal preimplantation embryos from fertile patients. Human Genetics, 1997, 99:755–760.
22. Handyside AH et al. Birth of a normal girl after in vitro fertilisation and preimplantation diagnostic testing for cystic fibrosis. New England Journal of Medicine, 1992, 327:905–910.
23. Kuliev A et al. Preimplantation diagnosis for thalassemias. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1998, 15:253–257.
24. Findlay I, Quirke P. Fluorescent polymerase chain reaction: Part I. A new method allowing genetic diagnosis and DNA fingerprinting of single cells. Human Reproduction Update, 1996, 2:137–152.
25. Rechitsky S et al. Accuracy of preimplantation diagnosis of single-gene disorders by polar body analysis of oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1999, 16:192–198.
26. Gianaroli L et al. Will preimplantation genetic diagnosis assist patients with a poor prognosis to achieve pregnancy? Human Reproduction, 1997, 12:1762–1767.
27. Gianaroli L et al. Gonadal activity and chromosomal constitution of in vitro generated embryos. Molecular and Cellular Endocrinology, 2000b, 161:111–116.
28. Munné S et al. Embryo morphology, developmental rates, and maternal age are correlated with chromosomal abnormalities. Fertility and Sterility, 1995, 64: 382–391.
29. Delhanty JD, Handyside A. The origin of genetic defects in the human and their detection in the preimplantation embryo. Human Reproduction Update, 1995, 1:201–215.
30. Gianaroli L et al. Aneuploidy detection in ART. 10th International Congress on Prenatal Diagnosis and Therapy, Barcelona, 19–21 June, 2000.
31. Sathanathan H et al. The sperm centriole: its inheritance, replication and perpetuation in early human embryos. Human Reproduction, 1996, 11:345–356.
32. Bahçe M et al. PGD of aneuploidy: were we looking at the wrong chromosomes? Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1999, 16:176–181.
33. Gianaroli L et al. Preimplantation diagnosis after assisted reproduction techniques for genetically determined male infertility. Journal of Endocrinological Investigation, 2000, 23:711–716.
34. Simon C et al. Increased chromosomal abnormalities in human preimplantation embryos after in vitro fertilisation in patients with recurrent miscarriage. Reproduction Fertility and Development, 1998, 10:87– 92.
35. Sermon K et al. Clinical application of preimplantation diagnosis for myotonic dystrophy. Prenatal Diagnosis, 1997, 17:925–932.
36. Sermon K e t a l. Preimplantation diagnosis for Huntington’s disease (HD): clinical application and analysis of the HD expansion in affected embryos. Prenatal Diagnosis, 1998, 18:1427–1436.
37. Sermon K et al. Preimplantation diagnosis for Fragile- X syndrome based on the detection of the nonexpanded paternal and maternal CGG. Prenatal Diagnosis, 1999, 19:1223–1230.
38. Gianaroli L et al. Guidelines for good practice in IVF laboratories. Human Reproduction, 2000, 15:2241– 2246.
39. Magli MC e t a l. Incidence of chromosomal abnormalities from a morphologically normal cohort of embryos in poor prognosis patients. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1998, 15:297–301
.
دراین وبلاگ سعی شده است تا مطالب آموزنده ای دررابطه علم ژنتیک پزشکی قرارداده شود تا همه بازدید کنندگان بهره کافی را ببرند